L'histoire évolutive des gènes de Brachyury chez Hydrozoa implique des duplications, des divergences et une néofonctionnalisation

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 9382 (2023) Citer cet article

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Brachyury, membre de la famille des gènes T-box, est largement connu pour son rôle majeur dans la spécification du mésoderme chez les bilatériens. Il est également présent dans les métazoaires non bilatéraux, tels que les cnidaires, où il agit comme un composant d'un système de structuration axiale. Dans cette étude, nous présentons une analyse phylogénétique des gènes de Brachyury au sein du phylum Cnidaria, étudions l'expression différentielle et abordons un cadre fonctionnel des paralogues de Brachyury dans l'hydrozoaire Dynamena pumila. Notre analyse indique deux événements de duplication de Brachyury au sein de la lignée cnidaire. La première duplication est probablement apparue chez l'ancêtre médusozoaire, entraînant deux copies chez les médusozoaires, tandis que la deuxième duplication est survenue chez l'ancêtre hydrozoaire, entraînant trois copies chez les hydrozoaires. Brachyury1 et 2 affichent un modèle d'expression conservateur marquant le pôle oral de l'axe du corps chez D. pumila. Au contraire, l'expression de Brachyury3 a été détectée dans des cellules probablement nerveuses dispersées de la larve de D. pumila. Les modulations pharmacologiques ont indiqué que Brachyury3 n'est pas sous régulation de la signalisation cWnt contrairement aux deux autres gènes Brachyury. La divergence des modèles d'expression et de la régulation suggère une néofonctionnalisation de Brachyury3 dans les hydrozoaires.

Brachyury (ou T) est un membre fondateur de la famille des facteurs de transcription T-box1 identifié pour la première fois dans une souche de souris mutante2. Les souris dépourvues d'un allèle de Brachyury présentent un phénotype à queue courte3, tandis que la perte létale prénatale des deux allèles entraîne de graves déficiences dans la formation du mésoderme et de la structure axiale4,5. Des études ultérieures ont démontré que Brachyury est hautement conservé et présent non seulement dans les accords, mais dans la plupart des animaux métazoaires allant des cténophores aux oursins, ainsi que chez les ichtyosporiens, les filastérés et plusieurs champignons à ramification précoce6,7,8,9.

La brachyurie joue un rôle crucial dans la formation de la notocorde dans divers accords (examinés dans 10) et la spécification du mésoderme dans les bilateria en général (examinés dans 11), et sa fonction primaire évolutive est peut-être associée à la démarcation de la couche germinale et à la morphogenèse pendant la gastrulation12,13. C'est également un élément important du réseau de régulation des gènes de la structuration axiale14.

Bien que les fonctions de Brachyury aient été examinées chez un nombre limité d'espèces, les schémas de son expression au cours du développement embryonnaire sont bien étudiés. L'un des domaines d'expression de Brachyury est détecté de manière conservatrice à un pôle de l'axe du corps (p. la plupart des animaux. Au sein des hydrozoaires, l'expression de Brachyury a été démontrée dans le site d'ingression cellulaire pendant la gastrulation chez les embryons de Clytia hemisphaerica19. La brachyurie est exprimée autour d'un blastopore chez les cténophores8, les anthozoaires12,20, les échinodermes21,22, les amphioxus23 et tous les vertébrés étudiés jusqu'à présent (revus dans 10), bien que ce domaine d'expression ait été perdu chez les ascidies24. Chez les annélides, les mollusques et les insectes, l'expression de Brachyury est également associée au blastopore, bien que ce domaine d'expression se dissolve à divers degrés (examiné en 11).

Une seule copie du gène Brachyury est présente dans les génomes de la plupart des métazoaires. Cependant, il existe plusieurs exceptions. Dans les accords, Xenopus laevis a quatre gènes Brachyury 25,26, où tbxt.L/tbxt.S (Xbra et Xbra2) et tbxt.2.L/tbxt.2.S (Xbra3) sont chacun considérés comme des alloallèles, issus de la récente duplication du génome25,26,27. X. tropicalis contient deux gènes Brachyury, dont l'un est regroupé avec Xbra/Xbra2 (tbxt) et l'autre correspond au gène Xbra3 de X. laevis (tbxt.2)28. Les poissons téléostéens, comme le médaka, le poisson zèbre et l'épinoche à trois épines, possèdent deux gènes Brachyury (Bra et Ntl) dans leurs génomes28,29. La brachyurie est présente en deux exemplaires dans le cordé basal amphioxus23,30,31. Selon l'analyse phylogénétique, les événements de duplication ne se sont pas produits chez l'ancêtre des accords, mais dans les trois lignées d'accords indépendamment28,32. Parmi les métazoaires non cordés, les hydrozoaires Hydra et C. hemisphaerica possèdent au moins deux copies du gène Brachyury13,33.

Une analyse phylogénétique approfondie est nécessaire pour comprendre l'évolution des gènes de Brachyury chez les cnidaires, en particulier, si la duplication des gènes s'est produite dans l'ancêtre hydrozoaire commun ou s'il y a eu plusieurs événements indépendants spécifiques à la lignée. Pour résoudre ce problème, nous avons cherché à reconstruire l'arbre phylogénétique des gènes Brachyury au sein du phylum Cnidaria. Nos données indiquent une première duplication de gène chez l'ancêtre commun de Meduzozoa. De manière frappante, Brachyury a subi une autre duplication dans la lignée hydrozoaire, où nous avons trouvé trois paralogues de Brachyury chez la plupart des espèces. Ensuite, l'analyse des profils d'expression génique des paralogues de Brachyury dans l'hydrozoaire Dynamena pumila au cours du développement normal et dans la colonie a démontré une dynamique d'expression très différente de DpBra3 par rapport à l'expression de DpBra1 et DpBra2. Puisqu'il est connu que Brachyury est un gène cible direct de la voie cWnt33,34, nous avons testé si les trois paralogues de Brachyury sont toujours sous régulation de la signalisation cWnt. Les données obtenues à partir des modulations pharmacologiques démontrent que DpBra3 est régulé différemment par rapport à DpBra1 et DpBra2. Pris ensemble, nos résultats suggèrent que la duplication des gènes Brachyury a entraîné la néofonctionnalisation de Brachyury3 dans la lignée hydrozoaire.

Pour aborder l'évolution de la famille de gènes Brachyury chez les cnidaires, nous avons d'abord effectué une recherche TBLASTX du transcriptome précédemment publié de D. pumila35 avec les séquences publiées du gène C. hemisphaerica Brachyury comme requête initiale. Nous avons récupéré trois séquences de gènes de type Brachyury à partir du transcriptome de D. pumila et les avons utilisées comme requêtes pour les recherches TBLASTX contre dix autres transcriptomes médusozoaires (voir "Méthodes"). En plus de quatre séquences d'anthozoaires déjà connues, un total de 33 séquences de Brachyury ont été identifiées à partir de 16 espèces de Cnidaria.

Un arbre de vraisemblance maximale a été généré à l'aide de séquences d'acides aminés traduites avec le modèle JTT ++ R5 le mieux adapté (Fig. 1). Pour cette analyse, un total de 41 séquences Brachyury ont été utilisées représentant tous les principaux groupes de métazoaires à l'exception de Porifera. Étant donné que la famille des facteurs de transcription T-box comprend des classes de gènes Tbx en plus de Brachyury9, des séquences de gènes métazoaires Tbx ont été utilisées comme groupe externe pour enraciner l'arbre. Pour tester la robustesse de la topologie arborescente, nous avons également utilisé le domaine T-box conservateur pour l'alignement. Un arbre de vraisemblance maximale supplémentaire avec la même topologie globale a été généré en utilisant uniquement les boîtes en T des séquences analysées (informations supplémentaires, Fig. S1).

Arbre phylogénétique ML des membres de la famille Brachyury, enraciné avec les gènes TBX. Les nombres aux nœuds sont des valeurs bootstrap, affichées sous forme de pourcentages. L'échelle indique la substitution d'acides aminés attendue par site. Les gènes de D. pumila sont en gras.

Toutes les espèces d'anthozoaires analysées possèdent un seul gène Brachyury (Fig. 1). Cependant, notre enquête transcriptomique a révélé plus de gènes Brachyury dans Medusozoa que Brachyury1 (Fig. 1). Les gènes de Brachyury uniquement médusozoaires appartiennent aux clades cubozoaires, scyphozoaires et hydrozoaires. Ils se regroupent avec les gènes Brachyury/Brachyury1 avec un support nodal élevé (valeur bootstrap 100%). Les gènes cubozoaires et scyphozoaires Brachyury2/3 se regroupent, et les gènes Brachyury hydrozoaires uniquement forment un groupe frère avec eux. À leur tour, les gènes Brachyury hydrozoaires uniquement comprennent deux groupes frères, Brachyury2 et Brachyury3, avec une valeur de bootstrap bien supportée (88%) (Fig. 1). Fait intéressant, une transcription de Brachyury précédemment étudiée (AJ428494.1) de Podocoryne carnea36 est orthologue à Brachyury3 selon notre analyse. Ainsi, toutes les espèces d'hydrozoaires analysées ont trois gènes Brachyury, à l'exception de Craspedacusta sowerbii et Hydra vulgaris, qui manquent respectivement de Brachyury2 et Brachyury3.

Pour une analyse plus approfondie des gènes de Brachyury dans Hydra, nous avons recherché des transcrits de Brachyury dans des modèles de gènes des assemblages de génomes Hydra 2.0 (Hydra magnipapillata)37 et HydraAEP (Hydra vulgaris)38 avec pipeline PIA3 modifié, ce qui nous a permis de récupérer la classe de protéines T-box. informations automatiquement. Cette analyse a confirmé que les génomes d'Hydra ne contiennent que deux gènes Brachyury et plusieurs gènes T-box (voir un exemple de sortie d'arbre dans les informations supplémentaires Fig. S2). La recherche manuelle n'a également récupéré que deux gènes Brachyury dans Hydra. Tous ces résultats augmentent la probabilité qu'Hydra ait effectivement perdu Brachyury3.

L'alignement de séquences multiples des séquences d'acides aminés complètes déduites des protéines Brachyury de D. pumila a révélé que leurs boîtes en T présentent une identité d'environ 70 à 77 %. En revanche, les séquences de pleine longueur ont une identité globale d'acides aminés inférieure, ainsi, les régions restantes sont moins conservées (Fig. 2a, b).

Comparaison de la conservation de la séquence parmi les protéines Brachyury hydrozoaires déduites. ( a ) Alignement des boîtes en T des protéines de D. pumila Brachyury. Les identités d'acides aminés sont bleues, le bleu clair indique que le résidu n'est pas identique mais au moins similaire au consensus de la colonne. ( b ) Matrice d'identité en pourcentage des boîtes en T et des protéines Brachyury pleine longueur chez D. pumila. Les couleurs ici et ci-dessous représentent les bandes de pourcentage d'identité : orange, 40 à 49 % ; jaune clair, 50–59%; jaune vif, 60–69 % ; menthe, 70–79%; vert, 80–89 %. ( c ) Architecture de domaine des protéines Brachyury hydrozoaires prédites. La boîte rouge correspond au domaine du répresseur R1. Un bord dentelé indique qu'une correspondance de séquence ne correspond pas à la longueur totale du HMM qui modélise une entrée pfam. Les nombres indiquent la longueur de la protéine en acides aminés. ( d ) Matrice d'identité en pourcentage des protéines Brachyury hydrozoaires pleine longueur.

En outre, nous avons effectué un alignement de séquences multiples de protéines Brachyury déduites, une prédiction de domaine fonctionnel par hmmscan et une recherche du domaine répresseur R1 avec une séquence de R1 de H. vulgaris Brachyury1 comme requête33. Les protéines hydrozoaires Brachyury1 partagent des identités plus élevées avec des gènes homologues d'espèces différentes que Brachyury2 et Brachyury3 (Fig. 2c, d). Les identités inter-espèces de Brachyury1 étaient également plus élevées que les identités entre les paralogues de Brachyury au sein de la même espèce (Fig. 2b, d). Seules les protéines Brachyury1 ont le fragment R1 de répression dans la région C-terminale (Fig. 2c, Informations supplémentaires Fig. S3). Les protéines scyphozoaires et cubozoaires Brachyury2/3 (Informations supplémentaires Fig. S3) et les protéines hydrozoaires Brachyury2 et Brachyury3 (Fig. 2c) l'ont perdue. La comparaison des séquences inter-espèces a en outre révélé que de toutes les protéines hydrozoaires Brachyury analysées, les protéines Brachyury2 ont les séquences les plus courtes positionnées à l'extrémité N-terminale de la boîte en T (par exemple, 20 acides aminés pour DpBra2), tandis que les protéines Brachyury3 sont les plus diverses en longueur et identité des acides aminés parmi les hydrozoaires (Fig. 2c, d).

Pour déterminer si les paralogues de Brachyury s'expriment différemment au cours du développement de D. pumila, nous avons analysé la distribution spatio-temporelle de leurs transcrits par hybridation in situ intégrale.

Chez D. pumila, la gastrulation est apolaire et procède principalement par épithélisation des cellules externes. Ce mode de gastrulation provoque des déformations de la surface embryonnaire et se traduit par de multiples concavités et indentations. Ainsi, au stade midgastrula, plusieurs surfaces toroïdales épithélisées composent une surface embryonnaire. Ces déformations s'estompent vers la fin de la gastrulation, alors que seules quelques indentations sont encore visibles. La dernière indentation a tendance à se situer dans le domaine oral de l'embryon. Cependant, cette dernière indentation n'est pas homologue à un blastopore39. À la fin de la gastrulation, l'hybridation in situ a révélé l'expression de DpBra1 dans un large domaine unitaire (Fig. 3a) qui ne chevauchait aucune région spécifique au sein de l'embryon au stade de la gastrula. Le signal a été visualisé à la fois dans l'ectoderme et l'endoderme (Fig. 3b, c). Au stade de la préplanule, le signal d'expression a été détecté dans des taches discrètes à la fois dans l'ectoderme et l'endoderme, principalement à l'extrémité orale de l'embryon (Fig. 3d, e). Dans la planula précoce, nous avons observé l'expression de DpBra1 dans le tiers oral de la larve (Fig. 3f, g). Dans la planula mature, DpBra1 était exprimé dans la moitié orale de la larve (Fig. 3h, i). Dans l'ectoderme, nous avons observé deux domaines d'expression de DpBra1. Dans la pointe, biaisé vers le signal d'expression du pôle oral a été visualisé dans les domaines apicaux des cellules ectodermiques. En outre, l'expression de DpBra1 était visible dans les cellules ectodermiques dispersées au milieu de la larve. Dans l'endoderme, l'expression n'était présente que dans quelques cellules à l'extrémité orale (Fig. 3j). La figure 3k représente les modèles d'expression de DpBra1 au cours du développement.

Modèles d'expression spatiale de DpBra1 au cours du développement embryonnaire. (a) L'expression est apparente dans un large domaine à la fin de la gastrulation. La pointe de la flèche blanche pointe vers l'ouverture au centre de la surface toroïdale. (b,c) Coupes transversales de l'embryon à travers les niveaux indiqués par les lignes pointillées blanches en (a). L'expression est présente à la fois dans l'ectoderme (Ect) et l'endoderme (End). (d) Les cellules d'expression sont situées au pôle oral de la préplanule. La double flèche indique la direction de l'axe corporel oral-aboral (OA). ( e ) Le signal DpBra1 est prédominant dans l'ectoderme et l'endoderme de la préplanule nettoyé avec la solution Murray's Clear (MC). (f, g) Large domaine d'expression biaisé vers le pôle oral dans la planula précoce. (h) Dans la planula mature, l'expression est observée dans l'extrémité orale et dans les cellules individuelles de la moitié orale du corps. (i) Coupe longitudinale de la planule passant par le niveau indiqué par la ligne pointillée blanche en (h). L'expression est localisée presque exclusivement dans l'ectoderme oral. (j) Un éclatement du (i). La flèche noire indique une cellule endodermique unique avec l'expression de DpBra1. La ligne pointillée noire marque la lame basale. ( k ) Le schéma des modèles d'expression de DpBra1 au cours du développement.

L'expression de DpBra2 a été détectée à la fois dans l'ectoderme et l'endoderme à la fin de la gastrulation et forme également un large domaine (Fig. 4a, b). Dans la préplanule / planule précoce, l'expression de DpBra2 a été observée dans la moitié orale de l'embryon avec un signal plus important au pôle oral (Fig. 4c). Transcriptions concentrées dans le cytoplasme périnucléaire des cellules ectodermiques (Fig. 4d). Dans la planula mature, nous avons observé l'expression de DpBra2 dans le tiers oral de la larve avec un biais vers le pôle (Fig. 4e, f). L'ARN DpBra2 a été visualisé dans les domaines apicaux des cellules ectodermiques (Fig. 4g). L'expression était également présente dans des cellules endodermiques uniques (Fig. 4g) comme dans le cas de DpBra1 (Fig. 3j). La figure 4h représente les modèles d'expression de DpBra2 au cours du développement.

Modèles d'expression spatiale de DpBra2 au cours du développement embryonnaire. (a) Domaine d'expression large à la fin de la gastrulation. La pointe de la flèche blanche pointe vers l'ouverture au centre de la surface toroïdale. (b) Gastrula nettoyé avec la solution Murray's Clear (MC). Le signal d'expression est détecté dans les cellules internes de l'embryon. (c) Biais vers le pôle oral, l'expression couvre la moitié de la préplanule/planule précoce. La double flèche indique la direction de l'axe corporel oral-aboral (O-A). (d) Coupe longitudinale de l'embryon à travers le niveau indiqué par la ligne pointillée blanche en (c). Les transcrits de DpBra2 sont visualisés dans le cytoplasme périnucléaire des cellules ectodermiques (Ect). Endoderme final. La ligne pointillée noire montre la lame basale. (e) L'expression orale est légèrement biaisée vers le pôle dans la planula mature. (f) Coupe longitudinale de la planule passant par le niveau indiqué par la ligne pointillée blanche en (e). L'expression est localisée principalement dans l'ectoderme oral. (g) Un agrandissement du (f). Les transcrits DpBra2 sont visualisés dans les domaines apicaux des cellules ectodermiques. La flèche noire indique une cellule endodermique unique avec l'expression de DpBra2. La ligne pointillée noire marque la lame basale. ( h ) Le schéma des modèles d'expression de DpBra2 au cours du développement.

DpBra3 était exprimé dans un large domaine à la fin de la gastrulation (Fig. 5a) selon un schéma similaire à ceux de DpBra1 et DpBra2. Cependant, le modèle d'expression de DpBra3 différait considérablement aux stades de développement ultérieurs. Au stade préplanula, le signal DpBra3 était visible sous la forme d'une ceinture au centre de l'axe oro-aboral (Fig. 5b, c). Au fur et à mesure du développement, la zone d'expression s'est étendue pour couvrir la partie centrale de la planule précoce (Fig. 5d). Les coupes longitudinales (Fig. 5e, f) ont révélé que les transcrits sont principalement présents dans les domaines basaux de cellules ectodermiques dispersées. Au fur et à mesure que la planula s'allongeait, l'expression se poursuivait dans la partie médiane de la larve dans des cellules ectodermiques discrètes (Fig. 5g, h). Un signal faible est également apparu dans l'endoderme aboral (Fig. 5g, h). Les coupes longitudinales de la planula mature ont clairement démontré que les corps en forme de bouteille (Fig. 5i) et triangulaires (Fig. 5j) des cellules exprimant DpBra3 étaient situés directement au-dessus de la lame basale ou se trouvaient entre l'endoderme et l'ectoderme. Ces derniers migrent probablement vers l'ectoderme à partir de l'endoderme (Fig. 5h). La figure 5k représente les modèles d'expression de DpBra3 au cours du développement.

Modèles d'expression spatiale de DpBra3 au cours du développement embryonnaire. (a) Domaine d'expression large à la fin de la gastrulation. La pointe de la flèche blanche pointe vers l'ouverture au centre de la surface toroïdale. (b,c) L'expression forme une ceinture centrale apparaissant dans l'ectoderme de la préplanule. La double flèche indique la direction de l'axe corporel oral-aboral (O-A). (d) Les cellules d'expression sont visibles sous la forme d'une large ceinture centrale dans la planula précoce. (e,f) Coupes longitudinales de la larve à travers les niveaux indiqués par les lignes pointillées blanches en (d). L'expression est strictement ectodermique, la coloration est visualisée principalement dans les domaines des cellules basales. ( g ) Une coloration intense est visible dans les cellules dispersées dans la région centrale de la larve mature. Une faible coloration est observée dans l'endoderme aboral. (h) Coupe longitudinale de la planule passant par le niveau indiqué par la ligne pointillée blanche en (g). Les cellules intensément colorées sont situées dans l'ectoderme. (i,j) Agrandissements du (h). Les corps colonnaires et triangulaires des cellules d'expression se trouvent juste au-dessus de la lame basale. Endoderme Ect, endoderme final. La ligne pointillée noire marque la lame basale. ( k ) Le schéma des modèles d'expression de DpBra3 au cours du développement.

En outre, nous avons examiné les profils d'expression des trois gènes Brachyury dans les pousses de la colonie de D. pumila. D. pumila forme des colonies à croissance monopodiale possédant une symétrie biradiale. Les pousses de la colonie sont composées de modules répétitifs. Chaque module est constitué d'un fragment de pousse au centre et de deux bouches d'incendie sur les côtés (Fig. 6a). De nouveaux modules se forment sur le dessus en raison du cycle morphogénétique répétitif dans l'organe spécifique - l'extrémité de croissance de la pousse (Fig. 6b). L'étape 1 représente l'état où le cycle morphogénétique n'a pas encore commencé (Fig. 6b1). Au stade 2, la croissance commence avec la surface apicale de la pointe incurvée (Fig. 6b2). Au stade 3, la pointe s'allonge et prend une forme hémisphérique (Fig. 6b3). Au stade 4, la pointe de croissance se divise en une partie centrale et deux parties latérales (Fig. 6b4). Les ébauches latérales se différencient davantage en bouches d'incendie, tandis que la partie centrale deviendra la nouvelle pointe de croissance des pousses (Fig. 6b1 *).

Modèles d'expression spatiale des gènes de Brachyury dans la colonie de D. pumila. (a) La pousse de la colonie de D. pumila. La parenthèse jaune montre la pointe de croissance de la pousse (sgt), la parenthèse blanche—un module (mdl) de la pousse. h hydranth. ( b ) Le schéma du cycle morphogénétique dans l'extrémité de croissance des pousses de D. pumila. Les nombres 1 à 4 indiquent les étapes successives de la morphogenèse. Après la formation du nouvel entre-nœud, le cycle recommence (astérisque). ( c ) Modèles d'expression spatiale des gènes de Brachyury dans les pointes de croissance des pousses aux stades 2 et 4 du cycle morphogénétique. Au stade 2, l'expression de DpBra1 est apparente dans la partie apicale centrale de l'extrémité de croissance des pousses. L'expression de DpBra2 est visible sur les côtés opposés de l'apex de la pointe de croissance des pousses. Au stade 4, l'expression de DpBra1 est uniforme à l'apex. L'expression de DpBra2 reste sur les côtés opposés de la pointe. Les flèches pointent vers les zones d'expression. L'expression de DpBra3 n'a pas été détectée. ( d ) Modèles d'expression spatiale des gènes de Brachyury dans les bouches d'incendie (coupe entière et longitudinale passant par le centre de la bouche d'incendie). L'expression des gènes Brachyury est apparente dans l'hypostome de l'hydranthe. Les pointes de flèches noires indiquent l'expression dans l'endoderme. La pointe de la flèche rouge indique l'expression dans l'ectoderme.

Nous avons analysé les schémas d'expression de trois gènes de Brachyury dans les pointes de croissance des pousses aux stades 2 et 4 du cycle morphogénétique et dans des bouches d'incendie différenciées entièrement formées. L'expression de DpBra1 et DpBra2 a été détectée dans l'ectoderme apical de la pointe de croissance (Fig. 6c). DpBra1 est exprimé dans la partie centrale de l'apex au stade 2 et uniformément au stade 4. L'expression de DpBra2 a été observée dans deux domaines sur les côtés opposés de l'apex aux stades 2 et 4. Ainsi, les domaines d'expression DpBra1 et DpBra2 ne se chevauchent pas au stade 2, mais sont co-exprimés au stade 4. L'expression de DpBra3 n'a pas été détectée dans l'extrémité de croissance des pousses.

L'expression de trois gènes de Brachyury a été observée dans l'hypostome de l'hydranthe (Fig. 6d). Une coupe longitudinale à travers le centre de l'hydranthe a révélé que DpBra1 était exprimé à la fois dans l'ecto- et l'endoderme. Le signal DpBra2 était clairement visible dans l'endoderme de l'hypostome, tandis que la présence d'un signal dans l'ectoderme n'est pas claire. Malheureusement, le signal DpBra3 était trop faible pour l'examen fin, mais semble être exprimé dans l'ectoderme (vu de la surface).

Il a été montré précédemment chez Hydra et C. hemisphaerica que deux gènes hydrozoaires Brachyury, Brachyury1 et Brachyury2, sont régulés par la signalisation cWnt13,33,40,41. Cependant, on ne sait pas si Brachyury3 est toujours un gène dépendant de cWnt après l'événement de duplication. Nous avons testé la dépendance de trois gènes Brachyury sur la voie cWnt chez D. pumila. Nous avons traité des embryons au stade de la gastrula avec différentes concentrations d'agents pharmacologiques pour moduler la voie cWnt, les avons cultivés jusqu'au stade de la planula, puis avons examiné les schémas d'expression de trois gènes de Brachyury dans les larves de planula de D. pumila (Fig. 7). L'azakenpaullone (Azk) active la signalisation cWnt et iCRT14 l'inhibe42,43,44. Il a été montré dans une étude précédente que l'hyper-activation de la signalisation cWnt entraîne l'élargissement du domaine oral larvaire, tandis que son inhibition conduit à la réduction du domaine oral chez D. pumila39.

L'expression de DpBra1 et DpBra2, mais pas de DpBra3, dépend de l'activité de la voie de signalisation cWnt. Les modulations pharmacologiques de la voie cWnt modifient la zone d'expression de DpBra1 et DpBra2 dans les larves de planula. Le nombre de cellules positives au signal endodermique augmente également (voir les détails pour les coupes longitudinales). L'hyperactivation des résultats cWnt dans le domaine d'expression DpBra3 décalé aborally. L'inhibition de cWnt n'affecte pas l'expression de DpBra3 de manière notable. La pointe de flèche pointe vers les cellules exprimant DpBra3 sur le pôle oral de la larve (voir détail). La double flèche indique la direction de l'axe corporel oral-aboral (O-A) pour toutes les larves.

Les larves traitées au DMSO (contrôle) avaient une morphologie et des schémas d'expression normaux de trois gènes de Brachyury (Fig. 7). Les traitements avec les concentrations croissantes d'Azk ont entraîné l'expansion progressive des domaines d'expression DpBra1 et DpBra2. Après un traitement Azk de 2, 5 μM, des signaux d'expression de DpBra1 et DpBra2 ont été observés dans toute la larve, à l'exception de la région la plus aborale. Le nombre de cellules endodermiques DpBra1 et Bra2 positives a également augmenté. Inversement, l'inhibition progressive de la signalisation cWnt avec iCRT14 a conduit à la diminution des domaines d'expression DpBra1 et DpBra2 dans la zone (Fig. 7).

De manière frappante, la suractivation de la signalisation cWnt n'a pas conduit à l'expansion du domaine d'expression de DpBra3. La ceinture de cellules exprimant DpBra3 s'est déplacée dans des positions de plus en plus aborales, quittant le domaine central. À la suite d'un traitement à 2, 5 μM d'Azk, plusieurs cellules exprimant DpBra3 ont été détectées au pôle aboral de la larve (Fig. 7: pointe de flèche). L'inhibition de la signalisation cWnt n'a pas modifié de manière notable le domaine d'expression de DpBra3 (Fig. 7).

Pour découvrir les différences fonctionnelles de trois gènes de D. pumila Brachyury, nous avons utilisé le système de test de capuchon animal Xenopus laevis. À l'aide de ce test, nous avons interrogé DpBra1, DpBra2 et DpBra3 pour leur capacité à affecter le destin cellulaire des cellules de la coiffe animale Xenopus naïves. Il est connu que les coiffes animales non traitées se différencient en tissu épidermique45, mais l'injection d'ARNm de Xenopus Bra ou d'Hydra Bra1 favorise la spécification du mésoderme, et l'ARNm d'Hydra Bra2 montre une activité d'induction neurale33,46. Nous avons injecté des ARNm coiffés codant pour DpBra1, DpBra2 ou DpBra3 dans la région animale d'embryons au stade de deux à quatre cellules (~ 1 ng par embryon), disséqué les coiffes animales au stade blastula (stade 8), cultivé jusqu'à ce que les embryons témoins atteint le stade tardif de la neurula (stade 18) et examiné l'expression du gène marqueur dans ces coiffes à l'aide de la RT-PCR conventionnelle ou quantitative (qRT-PCR). Des bouchons d'animaux non injectés ont été utilisés comme groupe témoin.

DpBra1 induit significativement (P < 0,0001) l'expression du gène marqueur mésodermique actc1.L (actine musculaire)47 (Fig. 8a) ainsi que l'expression d'un autre gène marqueur mésodermique, myod.S47. Étant donné que l'expression de myod.S était trop faible pour une quantification fiable dans le groupe témoin à l'aide de la qRT-PCR, nous avons utilisé l'électrophorèse sur gel pour montrer l'induction (Fig. 8c). DpBra1 n'a pas affecté l'expression du gène marqueur neural tubb2b.S47 (Fig. 8b) tandis que DpBra2 et DpBra3 n'ont pas affecté l'expression des gènes marqueurs neuronaux et mésodermiques (Fig. 8).

Phénotype moléculaire des capsules animales Xenopus injectées avec les gènes de D. pumila Brachyury. ( a, b ) Analyse RT-qPCR sur l'induction de actc1.L, myod2.S et tubb2b.S par les ARNm de D. pumila Brachyury. Les données sont présentées sous forme d'expression de changement de pli normalisée (moyenne ± écart-type) dans les groupes expérimentaux. n valeur n. Le nombre de groupes expérimentaux est de 3, 3 et 2 en (a); 3, 2 et 2 en (b). ***p < 0,001. ( c ) Électrophorèse sur gel pour myod.S après injection par les ARNm de D. pumila Brachyury. Contrôle négatif NC. Échelle d'ADN L. La pointe de flèche pointe vers la bande de 500 pb de l'échelle d'ADN. Voir l'image du gel non traité dans les informations supplémentaires Fig. S4.

Les duplications de gènes facilitent l'évolution des gènes régulateurs, entraînant l'expansion des familles de molécules de signalisation et de facteurs de transcription48,49. L'événement de duplication produit deux copies (paralogues) d'un gène qui sont toutes deux orthologues au gène "parent". L'évolution ultérieure peut conduire à des divergences : une copie conserve une grande similarité avec ses orthologues tandis que la seconde subit des modifications structurelles et peut être désignée comme copie fille ou fille50. Dans la présente étude, trois gènes paralogues du facteur de transcription Brachyury ont été trouvés dans la lignée hydrozoaire. La reconstruction phylogénétique suggère que le premier événement de duplication s'est produit avant la bifurcation du clade hydrozoaire (chez l'ancêtre commun des méduzosiens ou plus tôt). La copie "fille" de la première duplication (Brachyury2/3) a ensuite connu un événement de duplication supplémentaire chez l'ancêtre commun des hydrozoaires (Fig. 1).

Il existe trois scénarios principaux après la duplication de gènes. Le premier résultat conduit à la perte de fonction de la copie dupliquée qui devient un pseudogène ou est perdue. Deux autres résultats sont la sous-fonctionnalisation et la néofonctionnalisation51,52. En cas de sous-fonctionnalisation, deux copies dupliquées partagent la fonction d'origine du gène ancestral, et les deux sont nécessaires pour préserver l'intégralité de la fonction ancestrale51,53. Le chevauchement des domaines d'expression de deux doublons reflète souvent une sous-fonctionnalisation51. En cas de néofonctionnalisation, une copie conserve ses fonctions ancestrales, et l'autre est libre d'acquérir une nouvelle fonction, puisqu'elle est relâchée de la pression sélective53, et acquiert souvent le domaine d'expression différent du gène ancestral54,55. L'acquisition de nouvelles fonctions par les gènes régulateurs joue un rôle clé dans la diversification des voies de développement et des plans corporels chez les métazoaires56,57. Il est important de noter que le même duplicata peut également afficher à la fois des caractéristiques de sous- et de néofonctionnalisation en ce qui concerne différentes fonctions58.

L'évolution de Brachyury révèle des signes de sous- et de néofonctionnalisation. Chez les téléostéens, l'expression de deux gènes de Brachyury révèle le schéma d'accord commun28,59. Seule la perte simultanée des deux gènes de Brachyury récapitule le phénotype mutant homozygote de brachyury de souris4,28, indiquant une sous-fonctionnalisation suivie d'une duplication de Brachyury chez les téléostéens. Au contraire, la néofonctionnalisation semble suivre la duplication de Brachyury chez X. laevis car XBra3 (tbxt2.L/tbxt2.S) est distinct de XBra et XBra2 (tbxt,L/tbxt,S) en termes de fonction et de modèle spatio-temporel d'expression60. Au sein des hydrozoaires, les résultats de la duplication de Brachyury ont déjà été étudiés dans Hydra33. Bien que les deux paralogues de Brachyury soient exprimés dans l'hypostome d'Hydra, ils ont développé des séquences codantes distinctes et leurs fonctions ont divergé. Les auteurs postulent que les paralogues de Brachyury montrent un mélange de sous- et de néofonctionnalisation dans Hydra33. Cependant, on ne sait pas si des résultats similaires ont façonné les rôles des gènes Brachyury chez d'autres cnidaires.

Les gènes de la brachyurie sont également impliqués dans la structuration axiale chez d'autres cnidaires étudiés 14. Chez les espèces de cnidaires à gastrulation polaire, où elle est liée à la structuration axiale et se produit dans la région buccale de l'embryon61, l'expression de la brachyurie accompagne les mouvements morphogénétiques de la gastrulation12,19,20, 36. Dans la gastrulation de C. hemisphaerica, les paralogues de Brachyury (ChBra1 et ChBra2) affichent des schémas qui se chevauchent19 et sont importants pour la progression de la gastrulation13. Chez D. pumila pendant la gastrulation, les trois paralogues de Brachyury sont exprimés dans un large domaine (Figs. 3a, 4a, 5a). Contrairement aux espèces cnidaires à gastrulation polaire12, il est peu probable que les gènes Brachyury fournissent une démarcation de la limite ecto-endoderme chez D. pumila, car la spécification des couches germinales n'est pas associée à la polarité axiale et à la région orale en particulier lors de la gastrulation chez cette espèce39.

L'expression principalement orale des gènes de Brachyury se poursuit tout au long d'un cycle de vie cnidaire. La brachyurie est exprimée dans le pharynx des larves d'anthozoaires12,20 et dans l'ectoderme oral des larves d'hydrozoaires chez C. hemisphaerica et D. pumila, où l'expression de Brachyury1 et Brachyury2 est détectée19 (Figs. 3h – j, 4e – g). Étonnamment, les orthologues de Brachyury3 ne sont pas associés aux tissus oraux chez les larves d'hydrozoaires. Orthologue Brachyury précédemment examiné de P. carnea qui est exprimé dans les grappes ectoderm36 aborales selon notre analyse avec le groupe Brachyury3 (Fig. 1). Chez D. pumila, Brachyury3 affiche une expression dans des cellules ectodermiques discrètes triangulaires et en forme de bouteille (Fig. 5g – j), morphologiquement similaires aux cellules sensorielles du système nerveux cnidaire62, bien que Brachyury soit connue pour agir comme un répresseur neural dans l'anthozoaire Nematostella14. De plus, DpBra3 ne semble pas dépendre de cWnt, ce qui contraste avec la dépendance à Wnt rapportée de l'expression de Brachyury chez les cnidaires et les bilatéraux 14,63, y compris DpBra1 et DpBra2 (Fig. 6). Les orthologues de Brachury3 présentent une forte diversité de longueur et d'identité d'acides aminés parmi la famille de gènes hydrozoaires Brachyury (Fig. 2c, d). Les différences dans les séquences protéiques, la régulation et les domaines d'expression suggèrent que le Brachyury3 nouvellement dérivé a divergé vers différentes fonctions chez les espèces d'hydrozoaires.

Dans l'hydranth de D. pumila, le modèle d'expression de DpBra3 ne diffère pas radicalement des modèles de DpBra1 et DpBra2 et est conforme aux études précédentes33,36,64,65. Les trois paralogues de Brachyury ont été détectés dans l'hypostome de l'hydranthe avec des motifs qui se chevauchent (Fig. 6d). Probablement, la fonction originale de Brachyury dans une hydranthe hydrozoaire est associée à une spécification d'un domaine oral (un hypostome) dans son ensemble. Comme dans Hydra33, le chevauchement des domaines d'expression des paralogues de Brachyury dans les hypostomes des hydranthes de D. pumila suggère une sous-fonctionnalisation51.

Dans l'extrémité en croissance des pousses des colonies de D. pumila66, DpBra1 et DpBra2 sont fortement exprimés dans son ectoderme apical (Fig. 6c), qui pourrait être considéré comme un dérivé du domaine oral larvaire. L'association de l'expression de DpBra2 avec la formation d'ébauches d'hydranthe indique sa nouvelle fonction dans les ébauches d'hydranthe chez D. pumila.

La spécificité de la fonction Brachyury est principalement définie par les domaines N- et C-terminaux, mais pas par la T-box centrale9,67. Conformément aux études précédentes33 et à nos données (Fig. 8), une conservation fonctionnelle élevée des orthologues de l'hydrozoaire Brachyury1 est cohérente avec une conservation élevée de la séquence protéique (Fig. 2c). Cependant, nos données indiquent la divergence fonctionnelle de Brachyury2 et Brachyury3. Dans les essais sur les capuchons d'animaux Xenopus, DpBra2 et DpBra3 n'ont pas entraîné d'augmentation de l'expression des marqueurs mésodermiques actc1.L ou myod.S (Fig. 8a, c). Dans Brachyury2 et Brachyury3, les domaines N- et C-terminaux présentent une moindre identité d'acides aminés avec le gène ancestral et ont perdu le domaine de répression C-terminal ancestral R1 (Fig. 2a – c). Ces différences dans les domaines terminaux pourraient être responsables de la néo- et sous-fonctionnalisation de Brachyury2 et Brachyury3 chez les hydrozoaires, même s'il a été suggéré qu'elles se produisent principalement en raison de mutations dans les séquences régulatrices, plutôt que de mutations dans la séquence codante68.

Pris ensemble, nos données indiquent deux événements de duplication de Brachyury chez les cnidaires. Brachyury1 est le duplicata le plus conservateur, tant au niveau fonctionnel que séquentiel. Dans les hydrozoaires étudiés et chez D. pumila en particulier, il est supposé conserver sa fonction ancestrale en tant que composant crucial de la formation et de la structuration des axes. Les hydrozoaires Brachyury 2 et Brachyury 3 révèlent des caractéristiques de sous- et de néofonctionnalisation. Cependant, Brachyury3 présente une forte divergence de séquence et de fonctions parmi les hydrozoaires. Nos données sur Brachyury soutiennent le modèle d'une frontière indistincte entre la sous- et néofonctionnalisation et les résultats complexes pour les gènes dupliqués 58, et fournissent un modèle prometteur pour les études sur les scénarios post-duplication.

L'échantillonnage des colonies de D. pumila et des procédures expérimentales sur les embryons de D. pumila ont été réalisés à la Station biologique de la mer Blanche de Pertsov (Université d'État Lomonossov de Moscou) (baie de Kandalaksha ; 66°340 N, 33°080 E) pendant la période de D. pumila reproduction sexuée (juin-juillet). Les colonies sexuellement matures ont été maintenues dans de l'eau de mer naturelle à + 10–12 °C. Les observations de la monture entière ont été faites sous un stéréomicroscope Leica M165C.

Pour activer/inhiber la signalisation cWnt, les embryons gastrulants ont été traités avec 0,5/1/2,5 μM 1-Azakenpaullone (Sigma, Canada/Chine) ou 1/2,5/10 μM iCRT-14 (Sigma, USA/Chine) respectivement. Les solutions mères ont été préparées avec du DMSO à 10 mM, aliquotées et stockées à - 20 ° C. Les solutions de travail ont été préparées avant utilisation par dilution des solutions mères dans de l'eau de mer filtrée (FSW) jusqu'à la concentration finale. Les embryons témoins ont été exposés à 0,1 % de DMSO dans du FSW. Les solutions de travail ont été actualisées quotidiennement. L'incubation a été réalisée dans l'obscurité.

Pour analyser les relations phylogénétiques au sein de la famille des gènes brachyury, nous avons étudié 28 espèces de métazoaires. Les séquences de gènes ont été obtenues à partir de plusieurs sources (tableau d'informations supplémentaires S1). Les séquences bilatérales, cténophores, placozoaires et anthozoaires ont été obtenues à partir de la collection de nucléotides de la base de données NCBI. Certains transcriptomes de cnidaires assemblés ont été téléchargés à partir de bases de données publiques du NCBI (Aurelia aurita, Morbakka virulenta, Nemopilema nomurai, Podocoryna carnea, Lucernaria quadricornis, Tripedalia cystophora69, Dynamena pumila35, Polypodium hydriforme70 ou d'autres sites Web (Clytia hemisphaerica71, Hydractinia symbiolongicarpus72), Hydra38) . Les transcriptomes de Craspedacusta sowerbii et Margelopsis haeckelii ont été nouvellement assemblés par nous-mêmes. Les données pour Margelopsis haeckelii ont été collectées et séquencées de novo et sont disponibles dans notre laboratoire. Le contrôle de la qualité de lecture a été effectué avec le logiciel fastp (v.0.20.0)73. Les transcriptomes de novo ont été assemblés avec le logiciel rnaSPAdes (v.3.13.1)74. La qualité de l'assemblage a été évaluée à l'aide de BUSCO v.3.0.2 avec la base de données de métazoaires75.

Les gènes de Brachyury ABJ16449.1 et JAC85032.1 de C. hemisphaerica ont été utilisés comme requêtes pour la recherche tblastx locale des gènes de Brachyury dans le transcriptome de D. pumila. En utilisant trois séquences obtenues de gènes de type Brachyury de D. pumila comme requêtes, nous avons recherché des gènes de type Brachyury dans dix autres transcriptomes médusozoaires. Nous avons étudié 12 transcriptomes médusozoaires au total (tableau d'informations supplémentaires S1). Nous avons également utilisé des séquences de gènes de Brachyury bilatéraux, cténophores, placozoaires et anthozoaires.

Les séquences nucléotidiques sans séquence protéique correspondante dans la base de données NCBI ont été traduites à l'aide de Transdecoder v5.5.0. La recherche de boîtes T dans les séquences analysées a été effectuée avec l'outil NCBI Conserved Domain Search. Les alignements de séquences d'acides aminés et l'analyse phylogénétique ont été effectués avec l'algorithme MUSCLE dans le logiciel MUSCLE (v3.8.31)76. Les séquences des gènes Tbx ont été sélectionnées en tant que groupe externe. Les alignements de séquences ont été coupés en supprimant les régions mal alignées à l'aide de l'outil TrimAL, v.1.2rev5977. Une approche heuristique "automatisée1" a été utilisée pour sélectionner la meilleure méthode automatique pour ajuster nos alignements. Le rognage a été effectué sans réglage manuel. L'analyse phylogénétique a été réalisée avec le maximum de vraisemblance à l'aide du logiciel IQTree v.2.0-rc278. Le modèle JTT + R5 s'est avéré optimal. Pour évaluer les supports de branche, les valeurs de bootstrap ont été calculées en exécutant 1000 répétitions à l'aide d'un bootstrap ultrarapide (UFBoot)79. Les arbres ont été visualisés dans le logiciel FigTree v1.4.4. Les arbres phylogénétiques obtenus ont été traités avec Adobe Illustrator CC. Aucune correction n'a été apportée à la topologie de l'arbre et à la longueur des branches.

Nous avons recherché des transcrits de Brachyury dans des modèles de gènes des assemblages de génomes Hydra 2.0 et HydraAEP à l'aide du pipeline d'annotations phylogénétiquement informé PIA380. Le pipeline PIA3 est modifié à partir de PIA281 et est disponible sur GitHub82. Les modifications nous ont permis de récupérer automatiquement les informations sur la classe des protéines T-box.

Pour analyser les domaines fonctionnels de l'hydrozoaire Brachyury, des séquences de protéines sélectionnées ont été scannées par rapport à la base de données du modèle de Markov caché Pfam (HMM) à l'aide de hmmscan de HmmerWeb v.2.41.183. L'identification du domaine R1 conservé dans l'hydrozoaire Brachyury a été réalisée à l'aide du service d'alignement de séquences ClustalW84 avec le domaine R1 dans HyBra133 comme requête. L'architecture de domaine des protéines a été visualisée à l'aide de Pfam85. L'alignement de séquences multiples et le calcul de la matrice d'identité des protéines hydrozoaires Brachyury et des boîtes en T de D. pumila Brachyury ont été effectués à l'aide de ClustalW avec les paramètres par défaut et ombrés à l'aide de BOXSHADE 3.21.

La bibliothèque d'expression d'ADNc a été préparée par l'approche SMART à partir d'ARN embryonnaire total avec un kit de synthèse d'ADNc Mint (Evrogen, Russie). Des fragments de gène d'ADNc ont été isolés de la banque par PCR avec des amorces spécifiques au gène (voir tableau 1). Les amorces ont été conçues sur la base de séquences obtenues à partir du transcriptome séquencé (Illumina) de D. pumila35. Les fragments amplifiés ont été clonés dans le vecteur pAL-TA (Evrogen, Russie). Des sondes d'ARN antisens marquées à la digoxygénine ont été générées à partir de fragments de gènes, qui ont été amplifiés à partir de plasmides avec des gènes de D. pumila.

Le protocole d'hybridation in situ a été réalisé comme décrit précédemment en 66 pour les pousses et les hydranthes de D. pumila et en 39 pour les embryons de D. pumila. Une méthode d'hybridation in situ à base d'urée a été utilisée pour les hydranthes86.

Les pousses ont été fixées avec 0,2 % de glutaraldéhyde/4 % de formaldéhyde dans du FSW pendant 1 min, puis pendant une heure supplémentaire avec 4 % de formaldéhyde dans du FSW. Les échantillons ont été lavés trois fois avec du PTw (1 × PBS avec 0, 1% de Tween 20) et stockés dans du méthanol à 100% pas plus d'une nuit à -20 ° C jusqu'à l'hybridation. Les embryons ont été fixés avec du paraformaldéhyde à 4% dans du FSW pendant une nuit à + 4 ° C, rincés avec du PBS et stockés à -20 ° C dans du méthanol à 100% jusqu'à l'hybridation.

Les échantillons ont été réhydratés avec du PTw et traités avec de la protéinase K (80 μg/ml, 22 °C) pendant 1 à 3 min. Pour inactiver la phosphatase alcaline endogène et éviter un résultat faussement positif, les échantillons ont été chauffés à + 80 °C pendant 30 min. L'hybridation a été réalisée à 62 °C (pousses) ou 58 °C (embryons) avec des sondes d'ARN antisens marquées à la digoxigénine (1 ng/μL). Un anticorps anti-DIG conjugué à la phosphatase alcaline (Roche ; dilué au 1/2000) et un substrat NBT/BCIP (Roche) ont été utilisés pour détecter la sonde. Les échantillons colorés ont été lavés avec du PTw et du méthanol pour réduire la coloration de fond et montés dans du glycérol (87 %).

Plusieurs spécimens ont été traités avec la solution Murray's Clear (mélange 2:1 de benzoate de benzyle et d'alcool benzylique) pour obtenir un nettoyage optique des tissus. Plusieurs échantillons ont été intégrés dans de la résine Technovit. Des sections (5 à 7 μm d'épaisseur) ont été coupées à l'aide de l'ultramicrotome Reichert-Jung (Leica) Ultra-cut 701701 (Reichert-Jung, Autriche). L'imagerie des échantillons a été réalisée à l'aide d'un microscope Leica M165C (Leica, allemand) équipé d'un appareil photo numérique Leica DFC420C (5,0 MP).

Les Xenopus laevis de type sauvage ont été obtenus auprès du Centre européen de ressources sur le xénope (EXRC) de l'Université de Portsmouth, École des sciences biologiques, Royaume-Uni, ou Xenopus 1, États-Unis. L'entretien et les soins des grenouilles ont été effectués conformément aux procédures standard de l'installation AquaCore, Université de Fribourg, centre médical (RI_00544) et sur la base des recommandations fournies par les centres de ressources communautaires internationaux Xenopus NXR et EXRC ainsi que par Xenbase (http://www. xenbase.org/, RRID:SCR_003280). Ce travail a été effectué conformément aux lois allemandes sur la protection des animaux et a été approuvé sous le Registrier-Nr. G-18/76 par le Land de Bade-Wurtemberg.

Les œufs de X. laevis ont été collectés et fécondés in vitro, puis cultivés et microinjectés selon des procédures standard87. Les embryons ont été injectés deux fois/embryon avec des ARNm au stade deux ou quatre cellules à l'aide d'une configuration PicoSpritzer dans une solution 1/3× Modified Frog Ringer (MR) avec 2,5 % de Ficoll PM 400 (GE Healthcare, #17-0300-50 ), et ont été transférés après injection dans 1/3x MR contenant de la Gentamycine. La taille des gouttes a été calibrée à environ 7 à 8 nL par injection. Les embryons injectés ou non injectés (contrôle) ont été cultivés jusqu'à st. 8. Les coiffes des animaux ont été disséquées dans une solution de Barth modifiée 1 × (MBS) et transférées dans du MBS 0,5 × + gentamycine. 10 à 15 organoïdes ont été collectés dans TRIzol par condition et expérience.

Les séquences complètes de D. pumila Brachyury ont été amplifiées à partir de la bibliothèque d'ADNc et clonées dans le plasmide pCS2 + 8. pCS2 + 8 était un cadeau d'Amro Hamdoun (plasmide Addgene #34931 ; http://n2t.net/addgene:34931 ; RRID:Addgene_34931)88. Les ARNm ont été préparés à l'aide du kit Ambion mMessage Machine en utilisant Sp6 (#AM1340) additionné d'inhibiteur de RNAse (Promega #N251B) après linéarisation du plasmide avec Not1, et injectés à 50 ng/μl.

L'ARN total a été extrait à l'aide d'un protocole Trizol standard (Invitrogen #15596026) et utilisé pour la synthèse d'ADNc avec l'un ou l'autre des kits de synthèse d'ADNc iScript (Bio-Rad #1708891). Les réactions qPCR ont été réalisées à l'aide de Sso Advanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad #172-5275) sur un système en temps réel CFX Connect (Bio-Rad) dans des plaques PCR à 96 puits (marque #781366). La PCR conventionnelle et l'électrophorèse sur gel ont été réalisées de manière analogue sur un cycleur thermique S1000 (Bio-Rad). Voir le tableau 1 pour les amorces spécifiques au gène.

Les valeurs d'expression ont été normalisées par rapport à deux gènes de contrôle domestiques - EF1 et ODC (méthode 2∆∆Ct). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± écart type (sd) du changement de pli relatif (rFC), qui est un rapport du niveau d'ARNm normalisé de l'expression du gène analysé dans le groupe expérimental par rapport au groupe témoin.

L'analyse statistique des données d'expression génique normalisée après qRT-PCR a été réalisée dans le logiciel GraphPad Prism 5. La normalité de la distribution des données a été vérifiée par les tests de Kolmogorov-Smirnov. Les différences entre les groupes ont été évaluées avec une ANOVA unidirectionnelle suivie d'un test post hoc de Dunnet. La signification est indiquée par des astérisques sur les graphiques. Une valeur P inférieure à 0,05 a été considérée comme significative pour toutes les analyses. Toutes les expériences ont été conçues avec des conditions de contrôle appariées pour permettre une comparaison statistique. La valeur n est 7 pour un groupe témoin. La valeur n pour chaque groupe expérimental est indiquée sur des graphiques.

Les images ont été éditées avec les programmes Adobe Photoshop CS6. Pour obtenir une exposition et un contraste optimaux, des modifications de "Luminosité", "Contraste", "Exposition" et "Niveaux" pour le canal RVB ont été utilisées. Tous les outils ont été appliqués à l'image entière, pas localement.

Les séquences obtenues dans cette étude ont été déposées dans GenBank (OP828770–OP828776, OP902368, OP902367).

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Nous remercions NA Pertsov White Sea Biological Station de l'Université d'État de Moscou pour son aide et son soutien dans l'obtention d'échantillons et l'accès à toutes les installations et équipements nécessaires du "Centre de microscopie WSBS MSU". Nous sommes reconnaissants au Dr Amro Hamdoun pour le plasmide pCS2 + 8 (plasmide Addgene # 34931).

Le travail dans le laboratoire de Walentek est soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) dans le cadre du programme Emmy Noether (subvention WA3365/2-2) et dans le cadre de la stratégie d'excellence allemande (CIBSS-EXC-2189-Project ID 390939984). SK est soutenu par le projet n° 0088-2021-0009 de l'Institut Koltzov de biologie du développement de la RAS. L'étude de la structuration moléculaire de la colonie de D. pumila a été financée par RFBR, numéro de projet 20-04-00978a (à SK).

Laboratoire d'évolution de la morphogenèse, Institut Koltzov de biologie du développement RAS, Vavilova 26, Moscou, 119334, Russie

Alexandra A. Vetrova & Stanislav V. Kremnyov

Département d'embryologie, Faculté de biologie, Université d'État Lomonossov de Moscou, Leninskiye Gory 1/12, Moscou, 119234, Russie

Daria M. Kupaeva & Stanislav V. Kremnyov

Institut autrichien des sciences et technologies (ISTA), Am Campus 1, 3400, Klosterneuburg, Autriche

Alena Kizenko

Département d'évolution et de développement moléculaires, Centre de biologie des systèmes d'organismes, Université de Vienne, Althanstraße 14, 1090, Vienne, Autriche

Tatiana S.Lebedeva

Division rénale, Médecine interne IV, Centre médical, Faculté de médecine, Université de Fribourg, 79106, Fribourg, Allemagne

Pierre Valentin

CIBSS-Centre d'études de signalisation biologique intégrative, Université de Fribourg, 79104, Fribourg, Allemagne

Pierre Valentin

Institut d'anatomie et d'embryologie, Centre médical universitaire de Göttingen, Kreuzbergring 36, 37085, Göttingen, Allemagne

Nikoloz Tsikolia

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AAV a mené les expériences, effectué une analyse de séquence, effectué une analyse statistique, interprété les résultats, rédigé le projet de manuscrit et préparé les figures. DMK a assemblé des transcriptomes et effectué une analyse phylogénétique des séquences complètes de la protéine Brachyury. AK a recherché des gènes Brachyury dans les génomes d'Hydra à l'aide d'un pipeline d'annotation phylogénétiquement informé. TSL a participé à la réalisation d'expériences. PW a effectué un test de bouchon animal et une RT-PCR quantitative. NT a participé à la visualisation des données. SVK a conceptualisé, conçu et supervisé l'étude, mené les expériences, l'analyse phylogénétique des domaines T-box et interprété les résultats. Tous les auteurs ont lu, révisé et approuvé le manuscrit final.

Correspondance à Stanislav V. Kremnyov.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Vetrova, AA, Kupaeva, DM, Kizenko, A. et al. L'histoire évolutive des gènes de Brachyury chez Hydrozoa implique des duplications, des divergences et une néofonctionnalisation. Sci Rep 13, 9382 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35979-8

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Reçu : 20 janvier 2023

Accepté : 26 mai 2023

Publié: 09 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-35979-8

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